Bilogia molecular e forense

 

Oi Andressa,

   Como nas tecnologia de DNA recombinante e na PCR, o sequenciamento do DNA explora a complementariedade de pares de base ( Griffiths, 2013). Esse método é utilizado para sequenciar segmentos de DNA de até 900 pares de base.

O método de sequenciamento de Sanger consiste em utilizar um nucleotídeo que interrompe o processo de crescimento de um fita complementar à fita da região alvo, utilizando um nucleotídeo especial modificado chamado de didesóxi.

O método consiste em adicionar um nucleotídeo específico (didesóxi) que interrompe a cadeia complementar em crescimento. Esse nucleotídeo específico é preparado previamente e marcado por átomos radioativos ou por uma molécula fluorescente.

Finalmente é realizada a eletroforese dos fragmentos resultantes.

Assim as alternativas corretas são: II e IV, [ III(?)] pois

-A alternativa I está errada, porque o método de Sanger, como explicitado acima, é indicado para o sequenciamento de regiões com até 900 pares de bases de comprimento.

- A alternativa II está correta, pois o método consiste em utilizar uma fita alvo a partir da qual serão hibridizados os novos nucleotídeos em crescimento da fita complementar, assim é preciso abrir a dupla hélice para construir a fita complementar.

- A alternativa III não me parece clara, pode estar errada se estiver se refeindo à utilização de qualquer nucleotídeo para o crescimento da fita complementar, porque a chave do método é exatamente em parar o crescimento da nova fita no momento em que um nucleotídeo específico é adicionado, a alternativa fala em aleatoriamente, mas estará correta se o termo aleatoriamente foi usado indicando que não se sabe previamente a sequência de nucleotídeos, o nucleotideo didesóxi específico e conhecido, pois preparado previmente, interrompe o crescimento no ponto até então desconhecido. 

- A alternativa VI está correta, pois os fragmentos resultantes do sequenciamento são separadas por eletroforese.

 

Referência citada:

 

Griffiths, Anthony J. F. [Et al.]. Introdução à Genética. 10ª edição, Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 2013.

Com base no excerto fornecido, podemos avaliar as afirmativas sobre o sequenciamento de Sanger: I. A afirmativa está incorreta. O método de sequenciamento de Sanger é mais adequado para regiões menores do DNA, geralmente de 500 a 900 pares de base de comprimento. Regiões maiores requerem métodos de sequenciamento de próxima geração, como o sequenciamento de nova geração (NGS). II. A afirmativa está correta. No método de Sanger, o DNA alvo é separado em fitas simples que servem de molde para sintetizar as fitas complementares durante o processo de replicação. III. A afirmativa está correta. No sequenciamento de Sanger, a reação de replicação é feita usando nucleotídeos fluorescentes terminadores de cadeia, que são adicionados aleatoriamente durante a síntese da fita complementar. Cada um dos nucleotídeos terminadores é marcado com uma cor de fluorescência diferente para que a sequência possa ser determinada. IV. A afirmativa está correta. Após a replicação do DNA alvo utilizando os terminadores de cadeia fluorescentes, a série resultante de fragmentos de DNA é separada por eletroforese em gel. A análise dos fragmentos separados revela a sequência do DNA original. Portanto, as opções corretas são II e IV.

Com base no excerto da questão, apenas as opções II e IV estão corretas.

Uma vez que essas afirmações corroboram com com o método de sequenciamento de Sanger, que envolve a separação das fitas simples do DNA-alvo, a síntese das fitas complementares (como afirmado na afirmativa II) usando moléculas de DNA marcadas e um tipo específico de nucleotídeo, a separação dos fragmentos de DNA por eletroforese (como afirmado na afirmativa IV) e a análise dos fragmentos resultantes para revelar a sequência do DNA.

Já as alternativas I e III estão incorretas, pois, o sequenciamento de Sanger é mais adequado para regiões menores do DNA, geralmente com até 900 pares de base de comprimento (diferente da afirmação I, que diz que é utilizado em regiões com mais de 900 pares de bases). Para regiões maiores, técnicas de sequenciamento de próxima geração (Next-Generation Sequencing - NGS) são mais comumente utilizadas. E As fitas complementares não se encerram aleatoriamente com um tipo de nucleotídeo específico diferente (diferente da afirmação III, que diz que cada uma das fitas complementares se encerra aleatoriamente com um tipo de nucleotídeo específico diferente.). Na verdade, a síntese das fitas complementares ocorre usando uma mistura de nucleotídeos marcados que são incorporados de acordo com a sequência do DNA-alvo.