Tipos de Sequenciamento Genético

O sequenciamento genético é uma técnica que permite determinar a ordem de bases nitrogenadas que compõem a molécula de DNA, possibilitando estudar e identificar determinados genes para uma caracteristica, além de encontrar genes desconhecidos no genoma e estudar suas funções no organismo.

Tipos de sequenciamentos:

O sequenciamento didesóxi, ou sequenciamento de Sanger

Utiliza a DNA-polimerase com nucleotídeos terminadores de cadeia, chamados de didesoxirribonucleosídeos trifosfato. Esses ddNTPs são derivados dos desoxirribonucleosídeos trifosfato normais que não têm o grupo hidroxila 3´. Quando incorporado em uma fita crescente de DNA, eles bloqueiam o alongamento daquela fita. Para determinar a sequência completa de um fragmento de fita simples de DNA, o DNA é primeiro hibridizado com um iniciador de DNA curto, que é marcado com um corante fluorescente ou radioisótopo. A DNA-polimerase e quatro desoxirribonucleosídeos trifosfato normais (A, C, G ou T) são adicionados ao DNA com o iniciador, e são então divididos em quatro tubos de reação. Cada um desses tubos recebe uma pequena quantidade de um único didesoxirribonucleosídeo trifosfato terminador de cadeia (A, C, G ou T ). Que são apenas incorporados ocasionalmente, cada reação produz um conjunto de cópias de DNA que terminam em diferentes pontos na sequência. Os produtos dessas quatro reações são separados por eletroforese em quatro canaletas paralelas de um gel de poliacrilamida (marcados como A, T, C e G). Em cada canaleta, as bandas representam os fragmentos que foram terminados em um dado nucleotídeo, mas em diferentes posições no DNA. Fazendo a leitura das bandas em ordem, iniciando no final do gel e passando por todas as canaletas, a sequência de DNA da nova fita sintetizada poderá ser determinada.

SEQUENCIAMENTO DIDESÓXI AUTOMATIZADO

As máquinas totalmente automatizadas podem processar reações de sequenciamento didesóxi. O método automatizado utiliza uma quantidade excessiva de dNTPs normais mais uma mistura de quatro ddNTPs diferentes terminadores de cadeia, cada um ligado a um marcador fluorescente de cor diferente. Os produtos da reação são aplicados em um fino e longo gel capilar e separados por eletroforese. Uma câmara  lê a cor de banda conforme ela se move pelo gel e alimenta os dados em um computador que monta a sequência. 

SEQUENCIANDO GENOMAS INTEIROS

O sequenciamento shotgun: para determinar a sequência de nucleotídeos de um genoma inteiro, o DNA genômico é primeiramente fragmentado em pedaços pequenos e uma biblioteca genômica é construída, normalmente usando plasmídeos e bactérias . No sequenciamento shotgun, a sequência de nucleotídeos de dezenas de milhares de clones individuais é determinada; a sequência genômica inteira é, então, reconstruída agrupando (in silico) a sequência de nucleotídeos de cada clone, usando as sobreposições entre clones como guia. O método shotgun funciona bem para genomas pequenos e que não possuem DNA repetitivo.

Clones BAC:  A maioria dos genomas de plantas e animais é grande e contêm quantidades grandes de DNA repetitivo espalhado pelo genoma. O  genoma humano foi dividido inicialmente em fragmentos de DNA muito grandes (cada um com aproximadamente 100 mil pares de nucleotídeos) e clonado em BACs. A ordem das BACs ao longo do cromossomo foi determinada pela comparação do padrão dos sítios de clivagem das enzimas de restrição em um determinado clone BAC com o do genoma inteiro. Dessa forma, determinado clone BAC pode ser mapeado. Uma vez que uma coleção de clones BAC abrangendo todo o genoma foi obtida, cada BAC foi sequenciado pelo método shotgun. No final, as sequências de todos os insertos de BAC foram agrupadas usando o conhecimento da posição de cada inserto de BAC no genoma humano. Ao todo, aproximadamente 30 mil clones BAC foram sequenciados para completar o genoma humano.

TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO DE SEGUNDA GERAÇÃO

Esses métodos rápidos permitem que múltiplos genomas sejam sequenciados em paralelo em questão de semanas, sendo possivel examinar milhares de genomas individuais humanos, catalogar as variações nas sequências de nucleotídeos de pessoas em volta do mundo e descobrir mutações que aumentam o risco de várias doenças, do câncer ao autismo. Esses métodos também tornaram possível determinar a sequência genômica de espécies extintas, também foi possível compreender a base molecular dos eventos-chave evolutivos na árvore da vida. Existem vários  métodos de sequenciamento de segunda geração  estão em uso atualmente, no entanto irei abordar os dois dos mais comuns:

SEQUENCIAMENTO ILLUMINA

Em vez de usar células bacterianas para gerar essas bibliotecas, elas foram feitas usando a amplificação por PCR de bilhões de fragmentos de DNA, cada um ligado a um suporte sólido. A amplificação é feita de modo que as cópias geradas por PCR, em vez de flutuar em solução, permanecem ligadas na proximidade do fragmento de DNA original. Esse processo gera grupamentos de fragmentos de DNA, nos quais cada grupamento contém cerca de mil cópias idênticas de um pequeno pedaço do genoma. Sequenciamento Illumina, tem como base o método didesoxi cada nucleotídeo está ligado a uma molécula fluorescente removível (uma cor diferente para cada uma das quatro bases), no entanto os nucleotídeos carregam um grupamento químico que bloqueia a elongação pela DNA-polimerase, que pode ser removida quimicamente. O sequenciamento é, então, realizado como a seguir: os quatro nucleotídeos marcados fluorescentemente e a DNA-polimerase são adicionados a bilhões de grupamentos de DNA imobilizados sobre uma lâmina. Apenas o nucleotídeo apropriado (que é complementar ao próximo nucleotídeo no molde) é incorporado covalentemente a cada grupamento; os nucleotídeos não incorporados são removidos por lavagens e uma câmara digital de alta resolução capta uma imagem que registra qual dos quatro nucleotídeos foi adicionado à cadeia em cada grupamento. A marca fluorescente e o grupamento bloqueador 3-OH são, então, removidos enzimaticamente, lavados e o processo é repetido muitas vezes. Dessa forma, bilhões de reações de sequenciamento são realizadas simultaneamente. Pelo acompanhamento das mudanças de cor que ocorrem em cada grupamento, a sequência de DNA representada em cada ponto pode ser lida.

SEQUENCIAMENTO ÍON TORRENT™

O  genoma é fragmentado e os fragmentos individuais são ligados a esferas microscópicas. Utilizando PCR, cada fragmento de DNA é, então, amplificado de modo que cópias dele finalmente cubram a esfera na qual ele foi ligado inicialmente. Esse processo produz uma biblioteca de bilhões de esferas individuais, cada uma coberta com cópias idênticas de um determinado fragmento de DNA. As esferas são colocadas em poços individuais em um arranjo que pode guardar bilhões de esferas em uma polegada quadrada. A síntese de DNA é, então, iniciada em cada esfera com um oligonucleotídeo iniciador. Um íon hidrogênio (H+ ) é liberado (com pirofosfato) cada vez que um nucleotídeo é incorporado em uma cadeia de DNA crescente, e o método de íon torrent é baseado nesse simples fato. O arranjo de esferas é lavado com cada um dos quatro nucleotídeos, um de cada vez; quando um nucleotídeo é incorporado no DNA de determinada esfera, a liberação de um íon H+ altera o pH, que é registrado por um chip semicondutor localizado logo abaixo do arranjo de poços. Dessa forma, a sequência de DNA em determinada esfera pode ser lida a partir de um padrão de alterações de pH observadas.

Referência:  Alberts .,et al. Biologia molecular da célula.6. ed. Porto Alegre : Artmed, 2017.