Pirosequenciamento

O pirosequenciamento é uma técnica de sequenciamento de DNA baseada na detecção do pirofosfato (PPi) liberado  durante a síntese de DNA. Em uma cascata de 
reações enzimáticas, luz visível é gerada, a qual é proporcional ao número de nucleotídeos incorporados.

A preparação de amostras é feita da seguinte forma: fragmentos de DNA são ligados a adaptadores que facilitam a sua captura pelos “beads” (apenas um fragmento por “bead”). Uma emulsão água-óleo, contendo os reagentes para PCR e um “bead” por gota, é criada para amplificar cada fragmento individualmente. Após a amplificação, a emulsão é quebrada, o DNA é desnaturado e os “beads”, contendo um fragmento de DNA amplificado cada, são distribuídos nos poços de uma lâmina de fibra óptica.

No pirossequenciamento, as enzimas de sequenciamento e o “primer”(complementar ao adaptador nas extremidades do fragmento) são aplicados nos poços e, então, expostos a um tipo de nucleotídeo não marcado por vez, permitindo que a síntese da fita de DNA complementar prossiga. Quando um nucleotídeo é incorporado, pirofosfato é liberado e convertido a ATP, o qual estimula a conversão dirigida pela luciferase de luciferina em oxiluciferina e luz. Como resultado, o poço se ilumina.